гаряча лінія для пацієнтів

0 800 217 887

7:00 - 20:00

Консультація лікаря для пацієнтів

0 800 219 696

7:00 - 20:00

гаряча лінія для лікарів

0 800 752 180

7:00 - 20:00

Багатоканальний телефон для мешканців міста Київ

Кошик

Допомога ЗСУ

Головна
Інновації
Визначення холестерину ліпопротеїдів низької щільності: переваги методів ДІЛА

Визначення холестерину ліпопротеїдів низької щільності: переваги методів ДІЛА

08.12.2023

Ліпіди – це сполуки, розчинні в неполярних органічних речовинах, таких як хлороформ і ефір, але відносно нерозчинні в полярних розчинниках, таких як вода. Тому холестерин (ХС) і тригліцериди (ТГ) для перенесення потребують сполучення з транспортними білками – аполіпопротеїнами. Це забезпечує їх перебування у плазмі крові у складі водорозчинних комплексів – ліпопротеїдів (ЛП). Основна фізіологічна роль ЛП - забезпечення розчинності і транспортування ХС і ТГ.

Властивості ліпопротеїдів

Виділяють основні класи ЛП:

хіломікрони;
ліпопротеїди дуже низької щільності (ЛПДНЩ);
ліпопротеїди низької щільності (ЛПНЩ), ліпопротеїди високої щільності (ЛПВЩ);
ліпопротеїди проміжної щільності (ЛППЩ);
ліпопротеїн (α).

Класи ЛП відрізняються за хімічним складом, та, відповідно, відносною щільністю, розмірами часток та електрофоретичною рухомістю. Різне співвідношення білків, ТГ і ХС у складі різних класів ЛП визначає їх фізіологічні властивості і роль в обміні ліпідів. ЛП мають сферичну форму. Оболонку ЛП формують фосфоліпіди, вільний холестерин та білок, ядро містить переважно ХС і ТГ.

Ліпіди та білки мають різну середню густину - 1,0 і 1,4 г/мл відповідно, тому відносна густина частки ЛП визначається в основному співвідношенням білка і ТГ. ЛП з високим вмістом ТГ і низьким вмістом білка менш щільні (хіломікрони і ЛПДНЩ), ніж ЛП з високим вмістом білка і низьким вмістом ТГ (ЛПВЩ). Відповідно, при ультрацентрифугуванні ЛП розподіляються за відносною щільністю: чим більше ліпідів, тим менша щільність частки, і тим вище вони розташовуються у пробірці.

Чим відрізняються ліпопротеїди між собою

Тригліцериди — це ліпіди, що складаються з трьох жирних кислот, зв'язаних із молекулою гліцерину. ТГ є основними складовими ЛП, з максимальною їх концентрацією у хіломікронах та ЛПДНЩ. Максимальний вміст ТГ у складі хіломікронів відзначається протягом 3–6 год після прийому жирної їжі. Цей час варіює в залежності від швидкості всмоктування жирів.

ЛПНЩ утворюються з ЛПДНЩ та становлять близько 50% усіх ЛП плазми крові. До складу ЛПНЩ входить:

холестерин (до 50%);
білок (25%);
переважно apoB-100;
фосфоліпіди (20%);
трохи ТГ.

ЛПНЩ є основними холестеринвмісними частинками у плазмі крові, тому найбільше асоціюються з підвищеним серцево-судинним ризиком (ССР).

Основна функція ароВ-вмісних ЛП, в тому числі ЛПНЩ, це транспортування ХС і ТГ до тканин. АпоВ-вмісні частки підлягають внутрішньосудинним трансформаціям за участю ліпопротеїнліпази, яка гідролізує три- і дигліцериди до моногліцеридів і жирних кислот. Жирні кислоти накопичуються у жировій тканині та використовуються клітинами як джерело енергії.

Дослідження ліпідного профілю

Дослідження ліпідного обміну є важливим інструментом оцінки ССР як осіб із загальної популяції, так і фактором для визначення показів для призначення гіполіпідемічної терапії та критерієм оцінки її ефективності. Оцінка ліпідного обміну здійснюється за допомогою визначення вмісту загального ХС (ЗХ), ТГ та різних фракцій ЛП.

При оцінці показників ліпідного обміну пацієнта лікарю слід звертати увагу на чинники, які можуть вплинути на результат досліджень.

Так, спостерігається значна фізіологічна варіабельність рівнів ХС, ТГ та ЛП.

Коефіцієнт фізіологічної варіабельності може сягати для ЗХ до 6,4%, тобто, при повторних вимірюваннях у однієї особи його рівень в 95% зразків варіює в межах 13% від індивідуального середнього рівня.

Коефіцієнт фізіологічної варіабельності:

для ТГ може сягати до 23,7%;
для ХС ЛПНЩ – до 8,2%;
для ХС ЛПВЩ – до 7,5%;
для АпоВ – до 6,4%.

Таким чином, фізіологічна варіабельність може бути в кілька разів вища за аналітичну похибку лабораторного дослідження. Тому для визначення звичайної концентрації ЛП вимірювання рекомендовано виконувати в кількох зразках крові, взятої щонайменше з інтервалом в тиждень.

Також на рівні ліпідів і ЛП впливають біологічні фактори:

рівень ХС зростає з віком, починаючи з дитинства;
жінки зазвичай мають нижчі рівні холестерину, ніж чоловіки;
взимку рівень ХС вищий (сезонна варіабельність);
дієта здатна вплинути на рівень ХС в межах кількох тижнів. Тому перед дослідженням слід дотримуватись звичної дієти щонайменше 2 тижні і уникати значних коливань ваги;
лікарські препарати: контрацептиви, постменопаузальні естрогени, деякі антигіпертензивні препарати, антикоагулянти;
інші стани: захворювання щитоподібної залози, печінки, нирок, зловживання алкоголем, голодування, венозні окклюзії, нещодавній інфаркт міокарда, травми, катетеризація серця, гострі інфекції, вагітність.

Тому вимірювання ЛП рекомендовано не раніше, ніж через 8 тижнів після травми, гострої бактеріальної або вірусної інфекції та 3-4 місяці після пологів.

Положення тіла: при переході із положення стоячи в лежаче позасудинна рідина переходить до судинного русла і розбавляє складові плазми. Це спричинює зниження рівнів загального ХС, ХС ЛПНЩ, ХС ЛПВЩ, АпоВ, АпоА-1 більше ніж на 10%. При переході у положення стоячи зміни протилежні.

Відповідно, взяття біоматеріалу рекомендовано проводити у стандартизованому положенні пацієнта, зазвичай сидячи. Для уникнення згущення крові перед взяттям матеріалу бажано 5 хвилин перебувати в сидячому положенні. При необхідності проведення взяття крові у лежачому положенні, слід використовувати це положення і надалі для мінімізації коливань показників.

Також слід уникати тривалої венозної оклюзії, яка призводить до згущення крові з підвищенням рівня ХС до 10-15%.

Лабораторна оцінка ліпопротеїдів та холестерину ліпопротеїдів

Оскільки склад ХС кожного класу ЛП тотожний у різних людей, для оцінки концентрації ЛП зазвичай використовують визначення концентрації ХС ліпопротеїдів. Адже легше визначити кількість ХС ЛПНЩ, ніж масу ЛПНЩ, що складається з ХС, ТГ та білку. При цьому обидва вимірювання надають схожу інформацію про вміст ЛПНЩ у плазмі крові. Обидва ці показники використовувалися у популяційних дослідженнях ССР, тому їхня прогностична цінність підтверджена.

Основною проблемою при аналізі ЛП є відокремлення їх різних класів один від одного. Для цього існує багато методик, таких як:

ультрацентрифугування;
адсорбція;
гелева фільтрація;
афінна хроматографія;
електрофорез в різних середовищах;
імунохімічні процедури та їх різні комбінації.

Звісно, не всі методи придатні до широкого використання в клінічних умовах, тому зупинимось на тих, які використовуються у повсякденній практиці.

Метод ультрацентрифугування

Даний метод ґрунтується на фізико-хімічних властивостях ЛП. Завдяки наявності ліпідів ЛП мають меншу щільність, ніж інші макромолекули плазми. І кожен клас ЛП має різну щільність завдяки різному вмісту ліпідів, в тому числі, ТГ. Так, ЛПДНЩ та хіломікрони найбільш насичені ліпідами, тому у плазмі вони найбільш «плавучі», мають найменшу відносну щільність. Частки ЛПНЩ менші за розміром і вмістом ліпідів, їхня щільність більша; частки ЛПВЩ мають іще більшу щільність. Відповідно, ЛП можуть бути розділені на основі їхньої щільності.

Методи ультрацентрифугування вважаються найкращими засобами для порівняння класів ЛП. Але вони складні, трудомісткі і коштовні, тому використовуються переважно для наукових досліджень, а не в рутинній клінічній практиці.

Електрофоретичний метод

Наразі рідко використовується у клінічних умовах, оскільки має високу вартість. Принцип полягає у різній швидкості руху різних класів ЛП в агарному гелі. Так, хіломікрони залишаються у вихідному положенні, ЛПВЩ рухаються найшвидше, ЛПНЩ – найповільніше, а ЛПДНЩ - з проміжною між ЛПВЩ та ЛПНЩ швидкістю. Власне, за електрофоретичною рухомістю ЛП і отримали свої назви:

ЛПВЩ (α-ліпопротеїди) рухаються разом з α1-глобулінами;
ЛПНЩ (β-ліпопротеїди) – з β-глобулінами;
ЛПДНЩ (пре-β-ліпопротеїди) – з β2-глобулінами.

Найбільш успішно електрофорез використовується у поєднанні з іншими методами.

Важливо, що в основі розділення ЛП методами електрофорезу та ультрацентрифугування лежать їх різні властивості. Тому фракції, визначені різними методами, можуть не співпадати. Так, ЛПДНЩ методом ультрацентрифугування визначаються як ЛПДНЩ, але при електрофорезі вони рухаються з ЛПНЩ. Відповідно, при дослідженні одного зразку біоматеріалу методом ультрацентрифугування може визначатись підвищена концентрація ЛПДНЩ, але підвищена концентрація ЛПНЩ – при електрофорезі.

Методи осадження поліаніонами

Деякі ЛП осаджуються поліаніонами, такими як гепарин сульфат, сульфат декстрану та інші у присутності двохвалентних катіонів (Ca++, Mg++ та Mn++). Чим більше ЛП відрізняються один від одного, тим краще відбувається розділення. Історично, осадження поліаніонами найчастіше використовували для видалення апоВ-вмісних ЛП перед визначенням ХС ЛПВЩ. Ця процедура вимагає попередньої обробки зразка, яка не повністю автоматизована.

Більшість клінічних лабораторій замінили методи осадження на автоматизовані гомогенні аналізи для визначення ЛПВЩ і ЛПНЩ.

Визначення ХС ЛПНЩ

Основним класом ЛП, який асоціюється з атерогенезом та підвищеним ССР, є ЛПНЩ.

Методи вимірювання рівнів ХС ЛПНЩ базуються на припущенні, що ЗХ складається переважно з холестерину, що міститься в ЛПДНЩ, ЛПНЩ, ЛППЩ, ЛПВЩ та ЛП(а).

Існує кілька методів вимірювання рівня ХС ЛПНЩ, основні з них:

Найбільш поширений метод – розрахунок з використанням формули Фрідевальда.
Референтна лабораторна процедура - ультрацентрифугування для відокремлення ЛПНЩ від інших ЛП з подальшим аналізом.
Нещодавно розроблені однорідні (гомогенні) методи – пряме вимірювання ХС ЛПНЩ.

Розрахунок за формулою Фрідевальда

Це непрямий метод визначення ХС ЛПНЩ, розроблений ще в 1972 році Фрідевальдом, Леві та Фредріксоном. Загалом, у зразках плазми натще, ЛПНЩ містять ХС, відсутній у ЛПВЩ або ЛПДНЩ. Оскільки ЛПДНЩ містять більшість ТГ плазми крові, концентрація ХС ЛПДНЩ визначається на основі середнього відношення ТГ до ХС у ЛПДНЩ:

ХС ЛПДНЩ = ТГ/2,175

Таким чином, холестерин ЛПНЩ можна вирахувати за рівнянням:

ХС ЛПНЩ = ЗХ - ХС ЛПВЩ – ТГ/2,175

в якому індекс ТГ/2,175 представляє ХС ЛПДНЩ, результат виражений в ммоль/л.

При визначенні концентрації в мг/дл використовують коефіцієнт ТГ/5.

Рівень загального ХС, ТГ і ХС ЛПВЩ у плазмі крові визначають описаними вище методами.

Розрахунок за формулою Фрідевальда найчастіше використовується для оцінювання концентрації ХС ЛПНЩ у переважній більшості лабораторій. Але цей метод має значні обмеження, які походять із двох припущень, на яких, власне, він і ґрунтується.

По-перше, розрахунок припускає, що майже усі плазмові ТГ містяться у ЛПДНЩ. По-друге, метод припускає, що співвідношення ТГ/ХС у ЛПДНЩ є незмінним. Але жодне із цих припущень не є абсолютно вірним. Відповідно, метод не підходить для зразків біоматеріалу, взятих не натще, а також зразків, які містять хіломікрони. Адже в хіломікронах співвідношення ТГ до ХС значно вище, ніж у ЛПДНЩ. Навіть при відсутності хіломікронів, співвідношення ХС ЛПДНЩ до ТГ змінюється при підвищенні рівня ТГ, що призводить до похибок в оцінці ХС ЛПДНЩ.

Таким чином, розрахунок за формулою Фрідевальда не підходить для зразків біоматеріалу з високим вмістом ТГ. Похибка стає значущою при рівні ТГ більше 2,26 ммоль/л (200 мг/дл) і неприйнятно великою при рівні ТГ вище 4,52 ммоль/л (400 мг/дл).

Точність розрахунку також страждає при низьких рівнях ХС ЛПНЩ, що вплине на коректність оцінювання ССР у пацієнтів, які вже отримують ліпідознижуючу терапію.

Пряме вимірювання ХС ЛПНЩ (гомогенні методи)

Це повністю автоматизовані двореагентні процедури, які не потребують попередньої обробки та розділення в автономному режимі (звідси термін "гомогенні"), і можуть бути адаптовані до більшості аналізаторів. Тому вони дозволяють зменшити час виконання та загальні витрати на процедуру. А менша кількість етапів дослідження дозволяє мінімізувати можливі аналітичні похибки і досягти більшої точності результату.

Перевагою прямих методів визначення ХС ЛПНЩ є можливість їх використання при підвищеному рівні ТГ, які не впливають на результат дослідження навіть при високих концентраціях (більше 600 мг/дл). Попри відмінності у принципах роботи різних тест-систем, зазвичай використовується комбінація двох реагентів. Перший реагент вибірково видаляє не-ЛПНЩ (та/або стабілізує або пригнічує реакцію ЛПНЩ з ферментами), а другий реагент вивільняє ХС з ЛПНЩ з подальшим його вимірюванням ферментативно.

Ці методи є точними, хоча в окремих ситуаціях можуть давати розбіжності у порівнянні з референтними процедурами ультрацентрифугування, наприклад, при наявності аномальних ЛП.

При рівні ТГ менше 400 мг/дл гомогенні методи клінічно співставні, але не ідентичні через вплив аналітичної варіації, з розрахунком за формулою Фрідевальда. Але, на відміну від розрахунку, гомогенні дослідження надають клінічно значущі результати при рівні ТГ вище 400 мг/дл, що дозволяє використовувати їх для дослідження зразків, взятих не натще.

ПЕРЕВАГИ ДОСЛІДЖЕННЯ ХС ЛПНЩ В ДІЛА

Методика визначення ХС ЛПНЩ в ДІЛА - це гомогенний аналіз, призначений для прямого визначення рівнів ХС ЛПНЩ в сироватці або плазмі крові, що не вимагає виконання будь-яких етапів попередньої обробки чи центрифугування поза аналізатором та надає дослідженню ряд переваг:

Визначення здійснюється прямим методом, що дає можливість точно виміряти ХС ЛПНЩ при рівні ТГ у зразку > 4.52 ммоль/л.
Відповідність калібратора міжнародному стандарту - референтному методу CDC, визначена за допомогою кореляції зразків пацієнтів. Стандартизація дозволяє порівнювати результати лабораторій, методики яких простежуються за даним стандартом.
При проведенні кожного дослідження ХС ЛПНЩ аналізатор паралельно виконує дослідження на ліпемію зразку, що дає змогу виключити інтерференцію. У разі перевищення допустимих меж даного показника здійснюється розведення зразка, що знижує рівень ліпемії до прийнятного та усуває вплив інтерферуючих речовин.
ДІЛА відповідає критеріям міжнародної сертифікації якості. Окрім внутрішньої (щоденної) оцінки якості, ДІЛА бере участь у програмах зовнішньої оцінки якості досліджень. Це систематична перевірка коректності роботи тест-систем шляхом порівняння результатів між лабораторіями, які виконують дослідження даним методом.
ДІЛА систематично переглядає стратегію постановки внутрішньо-лабораторного контролю якості (ВЛКЯ) з використанням розрахунків 6-ти сигм. Це дає змогу моніторувати якість роботи тест-системи та планувати стратегію ВЛКЯ від початку впровадження методики протягом її використання. Також для ВЛКЯ застосовуються контрольні сироватки виробників третьої сторони (тобто виробники іншої компанії, відмінної від виробника реактивів).
Референтні значення показника ХС ЛПНЩ впроваджені згідно чинних клінічних настанов, що дозволяє індивідуалізувати отримані результати відповідно до групи ССР кожного пацієнта та покращити прихильність до прийому призначеної лікарем гіполіпідемічної терапії.