Определение холестерина липопротеидов низкой плотности: преимущества методов

Липиды – это соединения, растворимые в неполярных органических веществах, таких как хлороформ и эфир, но относительно нерастворимые в полярных растворителях, таких как вода. Поэтому холестерин (ХС) и триглицериды (ТГ) для переноса нуждаются в соединении с транспортными белками – аполипопротеинами. Это обеспечивает их нахождение в плазме крови в составе водорастворимых комплексов – липопротеидов (ЛП). Основная физиологическая роль ЛП – обеспечение растворимости и транспортировки ХС и ТГ.

Свойства липопротеидов

Выделяют основные классы ЛП:

• хиломикроны;
• липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП);
• липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), липопротеиды высокой плотности (ЛПВП);
• липопротеиды промежуточной плотности (ЛППП);
• липопротеин (α).
   

Классы ЛП отличаются по химическому составу и соответственно относительной плотности, размерам частиц и электрофоретической подвижности. Различное соотношение белков, ТГ и ХС в составе разных классов ЛП описывает их физические характеристики и роль в обмене липидов. ЛП имеют сферическую форму. Оболочку ЛП формируют фосфолипиды, холестерин свободный и белок, ядро содержит преимущественно ХС и ТГ.

Липиды и белки имеют разную среднюю плотность – 1,0 и 1,4 г/мл соответственно, поэтому относительная плотность частицы ЛП определяется в основном соотношением белка и ТГ. ЛП с высоким содержанием ТГ и низким содержанием белка менее плотны (хиломикроны и ЛПОНП), чем ЛП с высоким содержанием белка и низким содержанием ТГ (ЛПВП). Соответственно, при ультрацентрифугировании ЛП распределяются по относительной плотности: чем больше липидов, тем меньше плотность частицы, тем выше они располагаются в пробирке.

Чем отличаются липопротеиды между собой

Триглицериды – это липиды, состоящие из трех жирных кислот, связанных с молекулой глицерина. ТГ являются основными составляющими ЛП, с максимальной их концентрацией в хиломикронах и ЛПОНП. Максимальное содержание ТГ в составе хиломикронов отмечается в течение 3–6 ч после приема жирной пищи. Это время варьирует в зависимости от скорости всасывания жиров.

ЛПНП образуются из ЛПОНП и составляют около 50% всех ЛП плазмы крови. В состав ЛПНП входит:

• холестерин (до 50%);
• белок (25%);
• Преимущественно apoB-100;
• фосфолипиды (20%);
• немного ТГ.
   

ЛПНП являются основными холестеринсодержащими частицами в плазме крови, поэтому больше ассоциируются с повышенным сердечно-сосудистым риском (ССР).

Основная функция ароВ-содержащих ЛП, в том числе ЛПНП, это транспортировка ХС и ТГ в ткани. АпоВ-содержащие частицы подлежат внутрисосудистым трансформациям с участием липопротеинлипазы, которая гидролизует три- и диглицериды в моноглицериды и жирные кислоты. Жирные кислоты накапливаются в жировой ткани и используются клетками в качестве источника энергии.

Исследование липидного профиля

Исследование липидного обмена является важным инструментом оценки ССР как лиц из общей популяции, так и фактором для определения показаний гиполипидемической терапии и критерием оценки ее эффективности. Оценка липидного обмена производится посредством определения содержания общего ХС (ОХ), ТГ и различных фракций ЛП.

При оценке показателей липидного обмена пациента врачу следует обращать внимание на факторы, которые могут повлиять на результаты исследований.

Итак, наблюдается значительная физиологическая вариабельность уровней ХС, ТГ и ЛП.

Коэффициент физиологической вариабельности может достигать для ОХ до 6,4%, то есть при повторных измерениях у одного человека его уровень в 95% образцов варьирует в пределах 13% от индивидуального среднего уровня.

Коэффициент физиологической вариабельности:

• для ТГ может достигать 23,7%;
• для ХС ЛПНП – до 8,2%;
• для ХС ЛПВП – до 7,5%;
• для АПО – до 6,4%.
   

Таким образом, физиологическая вариабельность может быть в несколько раз выше аналитической погрешности лабораторного исследования. Поэтому для определения обычной концентрации ЛП измерения рекомендуется выполнять в нескольких образцах крови, взятой по меньшей мере с интервалом в неделю.

Также на уровне липидов и ЛП влияют биологические факторы:

• уровень ХС растет с возрастом, начиная с детства;
• женщины обычно имеют более низкие уровни холестерина, чем мужчины;
• зимой уровень ХС выше (сезонная вариабельность);
• диета способна повлиять на уровень ХС в пределах нескольких недель. Поэтому перед исследованием следует соблюдать привычную диету не менее 2 недель и избегать значительных колебаний веса;
• лекарственные препараты: контрацептивы, постменопаузальные эстрогены, антигипертензивные препараты, антикоагулянты;
• другие состояния: заболевания щитовидной железы, печени, почек, злоупотребление алкоголем, голодание, венозные окклюзии, недавний инфаркт миокарда, травмы, катетеризация сердца, острые инфекции, беременность.
   

Поэтому измерение ЛП рекомендовано не ранее чем через 8 недель после травмы, острой бактериальной или вирусной инфекции и 3–4 месяца после родов.

Положение тела: при переходе из положения стоя в лежачее сосудистая жидкость переходит к сосудистому руслу и разбавляет составляющие плазмы. Это приводит к снижению уровней общего ХС, ХС ЛПНЩ Щ, ХС ЛПВП, АПОВ, АПОА-1 более чем на 10%. При переходе в положение стоя перемены противоположны.

Соответственно, взятие биоматериала рекомендуется проводить в стандартизированном положении пациента, обычно сидя. Во избежание сгущения крови перед взятием материала желательно 5 минут находиться в сидячем положении. При необходимости проведения взятия крови в лежачем положении следует использовать это положение и в дальнейшем для минимизации колебаний показателей.

Также следует избегать длительной венозной окклюзии, приводящей к сгущению крови с повышением уровня ХС до 10-15%.

Лабораторная оценка липопротеидов и холестерина липопротеидов

Поскольку состав ХС каждого класса ЛП тождественен у разных людей, для оценки концентрации ЛП обычно используют определение концентрации ХС липопротеидов. Ведь легче определить количество ХС ЛПНП, чем массу ЛПНП, состоящую из ХС, ТГ и белка. При этом оба измерения предоставляют схожую информацию о содержании ЛПНП в плазме крови. Оба эти показателя использовались в популяционных исследованиях ССР, поэтому их прогностическая ценность подтверждена.

Основной проблемой при анализе ЛП является отделение их разных классов друг от друга. Для этого существует много методик, таких как:

• ультрацентрифугирование;
• адсорбция;
• гелевая фильтрация;
• аффинная хроматография;
• электрофорез в разных средах;
• иммунохимические процедуры и их разные комбинации.
   

Конечно, не все методы пригодны для широкого использования в клинических условиях, поэтому остановимся на тех, которые используются в повседневной практике.

Метод ультрацентрифугирования

Данный метод основан на физико-химических свойствах ЛП. Благодаря наличию липидов ЛП обладают меньшей плотностью, чем другие макромолекулы плазмы. И каждый класс ЛП имеет разную плотность благодаря разному содержанию липидов, в том числе, ТГ. Так, ЛПОНП и хиломикроны наиболее насыщены липидами, поэтому в плазме они наиболее «плавучие», имеют наименьшую относительную плотность. Частицы ЛПНП меньше по размеру и содержанию липидов, их плотность больше; частицы ЛПВП имеют еще большую плотность. Соответственно ЛП могут быть разделены на основе их плотности.

Методы ультрацентрифугирования считаются лучшими средствами для сравнения классов ЛП. Но они сложны, трудоемки и дорогостоящи, потому используются преимущественно для научных исследований, а не в рутинной клинической практике.

Электрофоретический метод

Пока редко используется в клинических условиях, поскольку имеет высокую стоимость. Принцип заключается в разной скорости движения разных классов ЛП в агарном геле. Так, хиломикроны остаются в исходном положении, ЛПВП двигаются быстрее всего, ЛПНП – самое медленное, а ЛПОНП - с промежуточной между ЛПВП и ЛПНП скоростью. По электрофоретической подвижности ЛП и получили свои названия:

• ЛПВП (α-липопротеиды) двигаются вместе с α1-глобулинами;
• ЛПНП (β-липопротеиды) – с β-глобулинами;
• ЛПОНП (пре-β-липопротеиды) – с β2-глобулинами.
   

Наиболее успешно электрофорез используется в сочетании с другими методами.

Важно, что в основе разделения ЛП методами электрофореза и ультрацентрифугирования лежат их разные свойства. Поэтому фракции, определенные разными методами, могут не совпадать. Так, ЛПОНП методом ультрацентрифугирования определяются как ЛПОНП, но при электрофорезе они движутся из ЛПНП. Соответственно, при исследовании одного образца биоматериала методом ультрацентрифугирования может определяться повышенная концентрация ЛПОНП, но повышенная концентрация ЛПНП – при электрофорезе.

Методы осаждения полианионами

Некоторые ЛП осаждаются полианионами, такими как сульфат гепарин, сульфат декстрана и другие в присутствии двухвалентных катионов (Ca++, Mg++ и Mn++). Чем больше ЛП отличаются друг от друга, тем лучше происходит разделение. Исторически осаждение полианионами чаще всего использовали для удаления апоВ-содержащих ЛП перед определением ХС ЛПВП. Эта процедура требует предварительной обработки образца, которая не полностью автоматизирована.

Большинство клинических лабораторий заменили методы осаждения на автоматизированные гомогенные анализы для определения ЛПВП и ЛПНП.

Определение ХС ЛПНП

Основным классом ЛП, который ассоциируется с атерогенезом и повышенным ССР, является ЛПНП.

Методы измерения уровней ХС ЛПНП базируются на предположении, что ЗХ состоит преимущественно из холестерина, содержащегося в ЛПОНП, ЛПНП, ЛППП, ЛПВП и ЛП(а).

Существует несколько методов измерения уровня ХС ЛПНП, основные из них:

1. Наиболее распространенный метод – расчет с использованием формулы Фридевальда.

2. Референтная лабораторная процедура – ультрацентрифугирование для отделения ЛПНП от других ЛП с последующим анализом.

3. Недавно разработанные однородные (гомогенные) методы – прямое измерение ХС ЛПНП.

Расчет по формуле Фридевальда

Это косвенный метод определения ХС ЛПНП, разработанный еще в 1972 году Фридевальдом, Леви и Фредриксоном. В общем, в образцах плазмы натощак, ЛПНП содержат ХС, отсутствующий в ЛПВП или ЛПОНП. Поскольку ЛПОНП содержат большинство ТГ плазмы крови, концентрация ХС ЛПОНП определяется на основе среднего отношения ТГ к ХС в ЛПОНП:

ХС ЛПОНП = ТГ/2,175

Таким образом холестерин Терин ЛПНП можно вычислить по уравнению:

ХС ЛПНП = ЗХ - ХС ЛПВП – ТГ/2,175,

в котором индекс ТГ/2,175 представляет ХС ЛПОНП, результат выражен в ммоль/л.

При определении концентрации в мг/дл используют коэффициент ТГ/5.

Уровень общего ХС, ТГ и ХС ЛПВП в плазме крови определяют описанными выше методами.

Расчет по формуле Фридевальда чаще всего используется для оценки концентрации ХС ЛПНП в большинстве лабораторий. Но этот метод имеет значительные ограничения, исходящие из двух предположений, на которых, собственно, он и основывается.

Во-первых, расчет предполагает, что почти все плазменные ТГ содержатся в ЛПОНП. Во-вторых, метод предполагает, что соотношение ТГ/ХС в ЛПОНП является неизменным. Но ни одно из этих предположений не является абсолютно верным. Соответственно, метод не подходит для образцов биоматериала, взятых не натощак, а также образцов, содержащих хиломикроны. Ведь в хиломикронах соотношение ТГ к ХС значительно выше, чем у ЛПОНП. Даже при отсутствии хиломикронов, соотношение ХС ЛПОНП к ТГ изменяется при повышении уровня ТГ, что приводит к погрешностям в оценке ХС ЛПОНП.

Таким образом, расчет по формуле Фридевальда не подходит для образцов биоматериала с высоким содержанием ТГ. Погрешность становится значимой при уровне ТГ более 2,26 ммоль/л (200 мг/дл) и неприемлемо большой при уровне ТГ выше 4,52 ммоль/л (400 мг/дл).

Точность расчета также страдает при низких уровнях ХС ЛПНП, что повлияет на корректность оценки ССР у пациентов, уже получающих липидоснижающую терапию.

Прямое измерение ХС ЛПНП (гомогенные методы)

Это полностью автоматизированные двухреагентные процедуры, не требующие предварительной обработки и разделения в автономном режиме (отсюда термин "гомогенные"), и могут быть адаптированы к большинству анализаторов. Поэтому они позволяют снизить время выполнения и общие затраты на процедуру. А меньшее количество этапов исследования позволяет минимизировать возможные аналитические погрешности и добиться большей точности результата.

Преимуществом прямых методов определения ХС ЛПНП является возможность использования при повышенном уровне ТГ, которые не влияют на результат исследования даже при высоких концентрациях (более 600 мг/дл). Несмотря на отличия в принципах работы различных тест-систем, обычно используется комбинация двух реагентов. Первый реагент избирательно удаляет не-ЛПНП (и/или стабилизирует или угнетает реакцию ЛПНП с ферментами), а второй реагент высвобождает ХС из ЛПНП с последующим его измерением ферментативно.

Эти методы точны, хотя в отдельных ситуациях могут давать расхождения по сравнению с референтными процедурами ультрацентрифугирования, например, при наличии аномальных ЛП.

При уровне ТГ менее 400 мг/дл гомогенные методы клинически сопоставимы, но не идентичны из-за влияния аналитической вариации, с расчетом по формуле Фридевальда. Но, в отличие от расчета, гомогенные исследования оказывают клинически значимые результаты при уровне ТГ выше 400 мг/дл, что позволяет использовать их для исследования образцов, взятых не натощак.

ПРЕИМУЩЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЯ ХС ЛПНП В ДІЛА

Методика определения ХС ЛПНП в ДІЛА — это гомогенный анализ, предназначенный для прямого определения уровней ХС ЛПНП в сыворотке или плазме крови, не требующий выполнения каких-либо этапов предварительной обработки или центрифугирования вне анализатора и предоставляющий исследованию ряд преимуществ:

Определение осуществляется прямым методом, позволяющим точно измерить ХС ЛПНП при уровне ТГ в образце > 4.52 ммоль/л.

Соответствие калибратора международному стандарту – референтному методу CDC, определенное посредством корреляции образцов пациентов. Стандартизация позволяет сравнивать результаты лабораторий, методики которых прослеживаются по настоящему стандарту.

При проведении каждого исследования ХС ЛПНП анализатор параллельно выполняет исследования на липемию образца, что позволяет исключить интерференцию. При превышении допустимых границ данного показателя осуществляется разведение образца, что снижает уровень липемии до приемлемого и устраняет влияние интерферирующих веществ.

ДІЛА отвечает критериям международной сертификации качества. Кроме внутренней (ежедневной) оценки качества, ДЕЛА принимает участие в программах внешней оценки качества исследований. Это систематическая проверка корректности работы тест-систем путём сравнения результатов между лабораториями, выполняющими исследование данным методом.

ДІЛА систематически пересматривает стратегию постановки внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК) с использованием расчетов 6-ти сигм. Это позволяет мониторить качество работы тест-системы и планировать стратегию ВЛКК с начала внедрения методики на протяжении ее использования.

Также для ВЛКК применяются контрольные сыворотки производителей третьей стороны (т.е. изготовители другой компании, отличной от производителя реактивов).

Референтные значения показателя ХС ЛПНП внедрены согласно действующим клиническим установкам, что позволяет индивидуализировать полученные результаты в соответствии с группой ССР каждого пациента и улучшить приверженность приему назначенной врачом гиполипидемической терапии.

Следует добавить, что определение ХС ЛПВП в ДІЛА также выполняется прямым гомогенным методом с соответствующими преимуществами.

ДІЛА работает для обеспечения наилучшей лабораторной практики, чтобы врачи и пациенты получали самые точные результаты.

Другие новости Все новости

16.12.2024

Рядом, чтобы заботиться о важном! Встречайте новое отделение ДІЛА в Киеве!

11.12.2024

С заботой о вашем здоровье – ждем вас в новом отделении ДІЛА в Черновцах!

06.12.2024

Здоровье рядом! Встречайте новое отделение ДІЛА в Киеве!